一、污染初步判断与紧急处理

1. 观察污染特征

• 菌体形态：取发酵液镜检（染色或直接观察），真菌通常表现为菌丝体、孢子或酵母状细胞。

• 色素表现：红色、黄色或黑色色素可能提示不同真菌（如红曲霉产红色素，黑曲霉产黑色素）。

• 发酵异常：pH异常波动、溶氧急剧变化、泡沫增多或产物产量下降。

2. 紧急终止发酵

• 立即停止搅拌与通气，关闭所有阀门，避免污染扩散。

• 对污染发酵液进行高温灭活（121℃灭菌20分钟），防止交叉污染。

二、污染源系统性排查流程

1. 设备灭菌环节

2. 操作过程污染

3. 培养基与种子液

4. 环境与辅助系统

三、真菌污染鉴定与抑制

1. 污染菌种鉴定

• 平板培养：将污染液接种至PDA培养基（28℃培养2-3天），观察菌落形态与色素（如曲霉呈绒毛状，产黑色/绿色孢子）。

• 分子鉴定：提取DNA进行ITS区域测序（通用引物ITS1/ITS4），比对GenBank数据库确认种属。

2. 针对性抑菌措施

• 物理清除：对罐体进行CIP清洗（1% NaOH + 0.1% SDS，80℃循环1小时）。

• 化学处理：使用抗真菌剂（如0.05%两性霉素B或0.1%苯甲酸），需验证对生产菌无抑制。

• 工艺调整：降低发酵温度（如从30℃降至25℃）或提高搅拌速率，抑制真菌生长。

四、预防措施与验证

1. 灭菌验证

• 使用生物指示剂（如嗜热脂肪芽孢杆菌片）验证灭菌效果，确保Fo值＞15分钟。

• 对罐体进行保压测试（0.12MPa维持30分钟），确认无泄漏。

2. 周期性维护

• 每月更换空气滤芯，每季度校准pH/DO电极。

• 建立污染事件记录表，分析高频污染环节（如70%污染源于空气系统）。

五、案例参考

某实验室5L罐反复出现红色色素污染，经排查发现：

1. 污染源：空气过滤器灭菌后未烘干，滤芯内部滋生红曲霉；

2. 解决方案：更换为一次性空气过滤器，灭菌后增加烘干程序（60℃烘箱2小时），污染率从20%降至0.5%。