一、如何判断发酵罐是否染菌？

1. 直观观察法

• 发酵液外观

• 正常：澄清或均一浑浊（与菌种特性相关）。

• 染菌：出现异常颜色（如红色、绿色、黑色）、分层、悬浮颗粒或大量泡沫。

• 气味变化

• 正常发酵气味（如酒精、酸味）变为腐臭味或霉味。

2. 理化参数异常

• pH异常波动：非正常代谢导致的pH骤升或骤降（如细菌污染可能产酸或产碱）。

• 溶氧（DO）异常：染菌后耗氧量突变（如酵母污染导致DO急速下降）。

• 产物产量下降：目标产物（如抗生素、酶）显著低于预期。

3. 微生物检测

• 镜检

• 取样发酵液，染色（如革兰氏染色）后显微镜观察，发现非目标菌形态（如杆菌、球菌混入酵母培养）。

• 平板培养

• 将样品接种至非选择性培养基（如LB琼脂）和选择性培养基（如PDA培养基），37℃和28℃分别培养24-48小时，观察杂菌菌落。

4. 分子检测（精准鉴定）

• PCR扩增16S rRNA（细菌）或ITS序列（真菌），测序比对数据库确认污染菌种。

二、染菌后的紧急处理

1. 立即终止发酵

• 关闭搅拌、停止通气，避免污染物扩散。

• 记录染菌时间、现象及操作参数，供后续分析。

2. 灭活与清理

• 污染液高温灭菌（121℃, 30分钟），罐体彻底CIP清洗（1% NaOH + 0.1% SDS循环清洗）。

3. 隔离污染批次

• 标记污染罐体，暂停使用直至完成全面排查。

三、染菌原因排查与解决方法

1. 灭菌不彻底

• 可能原因

• 灭菌温度/时间不足（如未达到121℃或维持时间＜20分钟）。

• 设备死角（如电极接口、取样阀）残留生物膜。

• 解决方法

• 使用生物指示剂（嗜热脂肪芽孢杆菌片）验证灭菌效果。

• 拆卸清洗死角，延长灭菌时间至30分钟，确保蒸汽穿透所有管路。

2. 操作失误

• 可能原因

• 接种、取样或补料时未严格无菌操作。

• 操作环境洁净度不达标（如超净台紫外灭菌不足）。

• 解决方法

• 规范操作流程：火焰封口、穿戴无菌手套/口罩、限制开罐时间。

• 定期检测操作台沉降菌（暴露琼脂平板≤3 CFU/30分钟为合格）。

3. 设备泄漏或污染

• 可能原因

• 空气滤芯破损、罐体密封不严或管路渗漏。

• 冷却水系统污染（如循环水含真菌孢子）。

• 解决方法

• 更换0.22μm疏水性空气滤芯，保压测试罐体气密性（0.12MPa维持30分钟无泄漏）。

• 冷却水添加0.02%次氯酸钠抑菌，定期更换水源。

4. 种子液或培养基污染

• 可能原因

• 种子液携带耐热芽孢或真菌孢子。

• 培养基灭菌后二次污染（如储存不当）。

• 解决方法

• 种子液预过滤（0.22μm滤膜）或添加抗生素（如50μg/mL卡那霉素）。

• 培养基分装后灭菌，储存时密封避光。

5. 环境因素

• 可能原因

• 实验室空气含菌量高（如通风系统污染）。

• 设备周围卫生差（如残留发酵液滋生杂菌）。

• 解决方法

• 安装HEPA空气过滤器，定期熏蒸消毒（过氧化氢雾化）。

• 每日清洁设备表面，使用75%乙醇或3%过氧化氢擦拭。

四、预防染菌的关键措施

1. 标准化操作流程（SOP）

• 制定灭菌、接种、取样等操作规范，定期培训考核人员。

2. 设备维护计划

• 每月更换空气滤芯，每季度校准传感器（pH、DO、温度）。

3. 环境监控

• 每周检测空气沉降菌、设备表面微生物（接触碟法）。

4. 工艺优化

• 对敏感菌种添加选择性抑制剂（如0.1%山梨酸钾抑制真菌）。

五、典型案例分析

• 案例1：某发酵罐连续3批染革兰氏阴性菌

• 原因：补料管路灭菌不彻底，内部残留生物膜。

• 解决：拆卸管路，超声波清洗后1% NaOH浸泡2小时，污染率从15%降至0.3%。

• 案例2：真菌污染导致发酵液变红

• 原因：空气过滤器受潮滋生红曲霉。

• 解决：更换一次性滤芯，灭菌后60℃烘干2小时，彻底杜绝污染。